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B5 Systembiotechnologie der Produktbildung bei Bakterien

(Deckwer; Komm. Leitung: Hempel, Jahn, Franco-Lara)

Die Modellierung biologischer Systeme ist ein wichtiger Teilaspekt der Bioverfahrenstechnik, dessen Potential im tieferen Verständnis der zellulären Abläufe und damit verbunden der gezielten Optimierung auf Zellebene liegt. Die Generierung der für eine Modellierung auf der Ebene des metabolischen Netzwerkes einer Bakterienzelle benötigten Daten und deren Integration in erste partielle systembiotechnologische Ansätze ist die Hauptaufgabe des Teilprojektes B5. Wichtige Vorarbeiten hierzu wurden im Teilprojekt A5 (Deckwer) geleistet, das in der 2. Antragsphase in das Teilprojekt B5 übergeht.
Bei den zu diesem Zweck verwendeten Modellorganismen handelt es sich um B. megaterium als Vertreter der Gram positiven Bakterien sowie um E. coli als Gram negatives Bakterium, da diese entscheidende Unterschiede hinsichtlich der heterologen Proteinproduktion im Bereich des Sekretionspotentials aufweisen. Die Arbeiten dieses Projekts konzentrieren sich auf B. megaterium. Als Modellprotein werden neben der bereits eingesetzten, mit ca. 170 kDa sehr großen Dextransucrase aus L. mesenteroides, weitere kleinere Proteine in Zusammenarbeit mit Teilprojekt A1 (Jahn) verfügbar werden. Um relevante Vergleichsdaten zur Verfügung zu haben, wird eines dieser Proteine (Hydrolase) auch in E. coli zur Expression gebracht, wobei auf etablierte Methoden zurückgegriffen werden kann.

In der 2. Antragsphase wird die Etablierung und Anwendung der 13C-Markierung zur Quantifizierung der intrazellulären Stoffflüsse bei B. megaterium von zentraler Bedeutung sein. Hierzu muss zunächst ein Isotopomerenmodell der zentralen Stoffwechselwege sowie der Aminosäuresynthesezweige in Kooperation mit Teilprojekt B6 (Zeng) erstellt werden. In anschließenden Batch- und Chemostatversuchen soll das Modell verifiziert werden. Im weiteren Verlauf der experimentellen Arbeiten wird der Einfluss der heterologen Proteinproduktion auf das Proteom und das Metabolom untersucht. Die Durchführung von Sensitivitätsanalysen des bis dato erstellten Modells sollte es möglich machen, potentielle Ziele für das Metabolic Engineering zu identifizieren, um die Proteinproduktion und –sekretion in Zusammenarbeit mit Teilprojekt A1 (Jahn) und ggf. später auch in A6 (Dübel) weiter zu optimieren. Dort entworfene Mutanten sollen in einem Prozess der ständigen Rückkopplung mit A1 (Jahn) und B6 (Zeng) auf ihre metabolischen Kapazitäten untersucht werden.

Parallel zu diesen Arbeiten und eng mit ihnen verknüpft soll die Proteomanalyse durch die Identifizierung weiterer Proteine in bisher nur unvollständig erfasste Teilbereiche erweitert werden. Die geplante Sequenzierung des Genoms von B. megaterium im Zeitrahmen der ersten Hälfte der 2. Antragsphase (Teilprojekt Z) wird hier entscheidende Impulse liefern, da dadurch in Zusammenarbeit mit A1 (Jahn) und B6 (Zeng) eine stammspezifische Proteindatenbank aufgebaut werden kann, die diese Arbeiten erheblich erleichtern wird. Zusammen mit A1 (Jahn) ist beabsichtigt, „custom designed“ DNA-Arrays zu entwickeln und bei kontrollierten Kultivierungsbedingungen einzusetzen, um Informationen über die Transkriptionsaktivität und die Regulation der wichtigsten zentralen Stoffwechselwege und des Proteinsekretionsapparates zu erhalten. Des Weiteren wird erwartet, dass die Auswertung der zeitlichen Verläufe der Expressionsmuster wertvolle Erkenntnisse im Bereich der Induktion der heterologen Proteinproduktion liefert. Die Zusammenführung dieser Daten („custom made“ Transkriptom, Proteom) mit denen der Metabolomanalyse, speziell des Fluxoms, soll es ermöglichen, umfassendere Beschreibungen und Interpretationen der Vorgänge auf zellulärer Ebene vorzunehmen und die Ausrichtung weiterer Experimente gezielter und effizienter zu gestalten.

Die bereits etablierte Hochzelldichtekultivierung von B. megaterium wird für die Produktivitätsoptimierung der von Teilprojekt A1 (Jahn) konstruierten Stämme fortgeführt werden. Die hierbei anfallenden Biomassen und Kultivierungsmedien (Produkt) werden für die Aufreinigungs- und Immobilisierungsexperimente sowie Anwendungsuntersuchungen an andere Teilprojekte weitergegeben.

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