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A3 Erzeugung, Screening und Charakterisierung modifizierter Glycosyltransferasen

(Buchholz/Hofer)

Die Synthese von Oligosacchariden und Derivaten spielt in der Pharmazie sowie im Lebensmittel- und Kosmetikbereich eine bedeutende Rolle. Die stereospezifische Synthese komplexer Kohlenhydratstrukturen auf chemischem Wege stellt jedoch auf Grund der unzureichenden Stereoselektivität und der notwendigen Schutzgruppenchemie ein erhebliches Problem dar. Daher gewinnen in zunehmendem Maße enzymkatalysierte Synthesen an Bedeutung. Die Anwendung von Leloir-Glycosyltransferasen ist allerdings eingeschränkt durch die hohen Kosten von nucleotidaktivierten Substraten bzw. deren Regenerierung und die eingeschränkte Verfügbarkeit der Enzyme, oft auch durch geringe Ausbeuten.

Besonders interessant sind daher die sog. Nicht-Leloir-Glycosyltransferasen (GTF), die einfache, nicht nucleotidaktivierte Saccharide (Saccharose, Stärke) als Substrate nutzen. Allerdings steht ihr enges Substrat-Spektrum dem Einsatz für die Synthese einer Vielzahl interessanter Oligo- und Polysaccharide im Wege. Die Modifizierung der Gene derartiger Glycosyltransferasen eröffnet hier die Möglichkeit, Zugang zu Enzymen mit neuen Substrat- und Produktspektren zu erhalten. Diese sollten über Glucose und Fructose hinaus weitere, bisher nicht übertragbare Zucker, wie Galactose, Mannose, Rhamnose u.a., ausgehend von den Monosacchariden, einem einfachen Glycosyltransfer zur Synthese von Oligosacchariden zugänglich machen.

Mit diesem Ziel wurden in Teilprojekt A2 (Hofer) in der ersten Antragsperiode Varianten der Dextransucrase (einer speziellen Glycosyltransferase) erzeugt, die mit einer geänderten Spezifität für den Glycosyldonor die Übertragung verschiedener Zucker zur Oligosaccharid-Synthese katalysieren sollen. Im laufenden Teilprojekt A3 (Buchholz) konnten dazu eine Reihe neuer Substrate zum Screening auf neue Glycosyltransferase-Varianten hergestellt, isoliert und charakterisiert werden. Die enzymatische Synthese dieser Zucker einschließlich Aufarbeitungsverfahren ist etabliert.

Im Folgeprojekt A3, in dem die ursprünglichen Teilprojekte A2 und A3 zusammengefasst werden, stehen folgende Ziele im Mittelpunkt: 1. Die aus der ersten Antragsperiode hervorgegangene Bibliothek von Varianten der Dextransucrase wird Screening-Cyclen unterworfen, um interessante und leistungsfähige Enzyme mit neuer Substratspezifität zu identifizieren. 2. Weitere neue Substrate für das Screening werden synthetisiert. 3. Screening-Methoden, die besonders empfindlich und für das High-Throughput-Screening geeignet erscheinen, werden entwickelt. Nach diesem primären Screening erfolgt ein Sekundär-Screening, das die Fähigkeit der Enzymvarianten zur Synthese neuer Oligosaccharide analysiert. 4. Aus einer Genbank, die verschiedene Varianten der Amylosucrase (AS, einer weiteren Glycosyltransferase) kodiert, werden Gene isoliert, mit denen neue Enzymaktivitäten produziert werden können. Die bekannte Struktur der Amylosucrase ermöglicht es, funktionell bedeutende Aminosäurereste gezielt auszutauschen.

Rekombinante AS-Varianten sollen mit den synthetisierten Substraten auf neue Aktivitäten hin untersucht werden. Hierdurch würde das Spektrum neuer Oligosaccharid-Synthesen systematisch erweitert.
Dem Screening folgt die Charakterisierung erhaltener Enzymvarianten mit den im Projekt hergestellten neuen Substraten und Akzeptoren. Eine neue Herausforderung sehen wir in der gezielten Suche nach Varianten mit veränderter Akzeptor-Spezifität, die die Glycosylierung von Nicht-Zuckern, z.B. Peptiden bzw. Derivaten mit den im Projekt synthetisierten neuen Substraten ermöglichen sollte.

Um auch Dextransucrasen (DS) -Varianten in gezielterer Weise erzeugen zu können, ist in Teilprojekt A7 (Heinz/Seibel) die Strukturbestimmung einer DS vorgesehen. Für die Strukturbestimmung sind durch gezielte Mutagenesen verschiedene DS-Varianten zu erzeugen. Dies sind kleinere Varianten zur Erleichterung der Kristallisation.

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